Inmovilización Covalente de la Tripsina en Sepharosa

Abstract

El presente trabajo determinó las mejores condiciones de tamaño de poro, temperatura, pH, carga enzimática y tiempo para inmovilizar covalentemente tripsina en una matriz de sepharosa. Se seleccionaron el tamaño de poro y temperatura mediante diseños experimentales unifactoriales con dos niveles. Se emplearon los tamaños de poro de las sepharosas 4 y 6 B-CL y las temperaturas de 15 y 35 ºC. Se encontraron los mayores valores de porcentajes de retención de actividad funcional (%RAF), de enzima inmovilizada (%EI) y de actividad enzimática inmovilizada (%AEI) para la sepharosa 6B-CL, los cuales fueron 33, 9 y 91 %, respectivamente. Además, se obtuvo el mayor %RAF (33%) a 15 ºC. Se fijó un rango de pH entre 10 y 10,5 y una carga de 25 mg/mL de matriz, que permitieron maximizar el %RAF, %EI y %AEI, con valores de 33,6; 85,5; y, 98,1%, respectivamente. Además, se estableció un tiempo de 12 h para alcanzar un preparado inmovilizado estable. La caracterización de la tripsina soluble e inmovilizada a las mejores condiciones, mediante el modelo Michaeliano, mostró valores de Km iguales a 2,16 y 3,32 mM, respectivamente, y valores de Vmax correspondientes a 4,22 y 2,15 mU/mg de tripsina.