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Título : Concentración por ultrafiltración tangencial de extractos enzimáticos con actividad ligninolítica y celulolítica generados por el hongo Phanerochaete chrysosporium
Autor : Lovato Vélez, María José
Palabras clave : Diseño de plantas
Biotecnología
Hongo Phanerochaete chrysosporium
Fecha de publicación : 11-may-2015
Editorial : Quito : EPN, 2015.
Resumen : Resumen .- El objetivo del presente trabajo fue la concentración, por ultrafiltración tangencial, de extractos enzimáticos con actividad ligninolítica y celulolítica, generados por el hongo Phanerochaete chrysosporium, en aserrín de eucalipto. Se cultivó el hongo en frascos de 500 mL con aserrín de eucalipto, durante 2 días a 30 °C. El extracto enzimático inicial (crudo) se obtuvo al recuperar, del aserrín, el complejo enzimático extracelular generado por el hongo, con una solución amortiguadora de pH 4,5. En el extracto enzimático inicial se detectaron actividades enzimáticas: lignino peroxidásica, manganeso peroxidásica y lacásica. No se encontró actividad celulásica, presumiblemente, por las condiciones de estrés del cultivo, que favorecieron el metabolismo secundario del Phanerochaete chrysosporium, donde se generan ligninasas. Se determinó que el proceso de concentración por ultrafiltración tangencial debía realizarse en dos etapas discontinuas, a las que se designó “ultrafiltración 1” y “ultrafiltración 2”. En la ultrafiltración 1 se utilizó una membrana de 100 kDa, para separar las impurezas con pesos moleculares superiores a las enzimas de interés, y en la ultrafiltración 2 una membrana de 10 kDa, para concentrar dichas enzimas. Se estudió la influencia de la presión transmembranaria (PTM) en el proceso de concentración, donde las mejores condiciones se obtuvieron con una PTM de 25 psi en la ultrafiltración 1 y de 35 psi en la ultrafiltración 2. Los valores máximos de concentración obtenidos fueron del 221 % para la actividad lignino peroxidasa, 135,83 % para la actividad manganeso peroxidasa y 110,30 % para la actividad lacásica. Adicionalmente, se sometieron los extractos enzimáticos concentrados a una electroforesis SDS-PAGE, que resultó fallida, presumiblemente, por las interferencias causadas por compuestos extraíbles hidrofílicos del eucalipto. Es posible que los taninos, presentes en los extractos enzimáticos, hayan formado enlaces con las enzimas, lo que impidió su adecuada migración y tinción en los geles de electroforesis. Se determinó la estabilidad de las actividades lignino peroxidásica, manganeso peroxidásica y lacásica de los extractos enzimáticos concentrados a tres condiciones de temperatura: ambiental (15 °C), refrigeración (3 °C) y congelación (-14 °C). Se analizaron los resultados con un modelo cinético de primer orden y se encontró que las condiciones de congelación eran las más favorables. Se terminó el trabajo con el diseño, a escala piloto, del sistema de ultrafiltración tangencial con una capacidad de 60 L, para lo que se utilizó la misma configuración del sistema Millipore TFF a escala de laboratorio. Abstract .- The objective of this project was the concentration by tangential ultrafiltration, of ligninolytic and cellulolytic activity enzymatic extracts, generated by the fungus Phanerochaete chrysosporium in eucalyptus sawdust. The fungus was grown in 500 mL flasks with eucalyptus sawdust, for 2 days at 30 ° C. The initial enzyme extract (crude) was obtained by retrieving, from sawdust, the extracellular enzyme complex produced by the fungus, with a buffer solution of pH 4.5. Lignin peroxidase, manganese peroxidase and lacásica activities were detected in the initial enzyme extract. Cellulase activity was not found, presumably by cultivation stress conditions, which favored Phanerochaete chrysosporium secondary metabolism, where ligninasas are generated. It was determined that the concentration tangential ultrafiltration process had to be performed in two discrete stages, which was designated "ultrafiltration 1" and "ultrafiltration 2". 100 kDa membrane was used in the ultrafiltration 1 to remove impurities with higher molecular weights than interest enzymes, and 10 kDa membrane in ultrafiltration 2 to concentrate those enzymes. The transmembrane pressure (TMP) influence in the concentration process was studied. the optimum conditions were obtained with PTM = 25 psi in ultrafiltration 1 and 35 psi in ultrafiltration 2. The maximum concentration values obtained were 221% for lignin peroxidase activity, 135.83% for manganese peroxidase activity and 110.30% for laccase activity. Additionally, an SDS-PAGE electrophoresis was realized with the concentrated enzyme extracts, which was unsuccessful, presumably due to the interference caused by removable hydrophilic compounds in eucalyptus. Tannins present in the enzymatic extracts could have formed links with enzymes, preventing proper migration and staining on electrophoresis gels. Lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase activities stabilities were determined in the concentrated enzyme extracts at three temperature conditions: ambient (15 ° C), cooling (3 ° C) and freezing (-14 ° C). The results were analyzed using a first order kinetic model and was found that the freezing conditions were the most favorable. The project was completed with a pilot scale tangential ultrafiltration system design, with capacity of 60 L, for which, the same configuration Millipore TFF system at laboratory scale was used.
Descripción : 134 hojas : ilustraciones, 29 x 21 cm + CD-ROM 6241
URI : http://bibdigital.epn.edu.ec/handle/15000/10547
Aparece en las colecciones: Tesis Ing. Química (IQUIM)

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