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Título : Purificación y caracterización de inhibidores de tripsina provenientes de semillas de amaranto, arveja, chocho, fréjol y sangorache, mediante cromatografía de afinidad
Autor : Echeverría Paredes, Paulina Alejandra
Palabras clave : Biotecnología
Bioquímica
Evaluación económica
Fecha de publicación : 22-sep-2014
Editorial : Quito : EPN, 2014.
Resumen : Resumen .- Las harinas de las semillas de amaranto, arveja, chocho, fréjol y sangorache se desengrasaron y se sometieron a un proceso de extracción, mediante su suspensión en solución tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 1,5 h. Los extractos obtenidos se fraccionaron en permeados (<10 kDa) y retenidos (10-50 kDa), a través de membranas de ultracentrifugación, y se ensayó su capacidad inhibidora de tripsina. Se seleccionaron los extractos inhibidores más activos según la actividad inhibidora específica alcanzada, después de su purificación parcial por tratamiento calórico (T = 60 °C, t = 30 min) y precipitación de proteínas con TCA (5 %). Se eligieron el permeado y retenido de la semilla de sangorache con valores de actividad de 19,22 ± 0,40 y 39,88 ± 0,69 mU/mg, respectivamente. Estos extractos se purificaron por cromatografía de afinidad en una matriz de tripsina-glioxil-sepharosa 6B-CL. A partir del permeado se obtuvieron los lotes I, II y III, con actividades inhibidoras de 17,32; 762,80; y, 291,17 mU/mg, respectivamente. Simultáneamente, del retenido se tuvieron los lotes IV, V y VI, con actividades inhibidoras de 58,13; 1 024,24; y, 389,23 mU/mg, respectivamente. Luego, los seis lotes fueron liofilizados a -67 °C y un vacío de 10 Pa. Por espectrometría de masas MALDI-TOF, se encontraron los picos de mayor abundancia en 9 159,94 y 8 102,71 Da. Además, la caracterización cinética determinó la presencia de dos tipos de inhibidores; el inhibidor I correspondió a un inhibidor competitivo, con una constante de inhibición (Ki) de 0,066 mM, y el inhibidor II, con características de inhibición mixta, tuvo una Ki de 0,274 mM y una Ki’ de 0,101 mM. Finalmente, se determinó que el costo de obtener 4,67 mg de inhibidores de tripsina, en el extracto purificado a partir de 25 g de semillas de sangorache, fue de 15,08 $/mg de inhibidor. Abstract .- The flours of amaranth, pea, lupine, bean and sangorache seeds were degreased and put through a extraction process, by their suspension with a 50 mM, pH 7,5 sodium phosphate buffer solution, during 1,5 h. The resulting extracts were fractionated on permeates (< 10 kDa) and retentates (10-50 kDa) through ultracentrifugation membranes, and their trypsin inhibitor activity was measured. The most active Trypsin inhibitors were selected by their specific inhibitor activity reached after their partial purification with a heat treatment (T = 60 °C, t = 30 min) and protein precipitation with TCA (5 %). The permeate and retentate of sangorache seeds, with activity values of 19,22 ± 0,40 and 39,88 ± 0,69 mU/mg, respectively, were chosen; those extracts were purified by affinity chromatography, in a matrix of trypsin-glioxil-sepharose 6B-CL. From the permeate, the lots I, II and III with specific inhibitor activities of 17,32; 762,80; and, 291,17 mU/mg, respectively, were obtained. Simultaneously, from the retained, the lots IV, V and VI with specific inhibitor activities of 58,13; 1 024,24; and, 389,23 mU/mg, respectively, were obtained. The six lots were lyophilized at -67 °C and a vacuum of 10 Pa. The largest peaks were found in 9 159,94 and 8 102,71 Da through mass spectrometry MALDI-TOF,. Also, a kinetic characterization determined two types of inhibitors; the inhibitor I, a competitive inhibitor with an inhibition constant (Ki) of 0,066 mM, and the inhibitor II, with noncompetitive inhibition characteristics, which had a Ki of 0,274 mM and a Ki’ of 0,101 mM. Finally, the cost to obtain 4,67 mg of trypsin inhibitor, in the purified extract from 25 g of sangorache seeds, was 15,08 $/mg of inhibitor.
Descripción : 153 hojas : ilustraciones, 29 x 21 cm + CD-ROM 5799
URI : http://bibdigital.epn.edu.ec/handle/15000/8626
Aparece en las colecciones: Tesis Ing. Química (IQUIM)

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